Metódy a postupy laboratórnych-praktických cvičení

Najvhodnejším fyziologickým prostredím pre červené krvinky je izotonické prostredie krvnej plazmy. V prostredí s nižším osmotickým tlakom ako má krvná plazma (t. j. v hypotonickom roztoku) erytrocyty prijímajú vodu, zväčšujú svoj objem, ale hemolyzujú až pri určitom stupni hypotónie roztoku. Z toho vyplýva, že normálne červené krvinky majú určitú odolnosť voči hypotonickým roztokom. Túto odolnosť erytrocytov, čiže osmotickú rezistenciu voči hypotonickému prostrediu zisťujeme v rôzne koncentrovaných hypotonických roztokoch NaCl. 0,9% roztok NaCl má rovnaký osmotický tlak ako krvná plazma, preto ho označujeme ako izotonický.

Koncentrácia NaCl, pri ktorej začnú hemolyzovať najmenej odolné erytrocyty, vyjadruje minimálnu osmotickú rezistenciu. Maximálna osmotická rezistencia je určená zase takou koncentráciou hypotonického roztoku NaCl, pri ktorej hemolyzujú aj tie najodolnejšie červené krvinky. Rozdiel medzi minimálnou a maximálnou osmotickou rezistenciou je rezistenčná šírka. K hemolýze erytrocytov dochádza aj v hypertonickom roztoku v dôsledku zmrašťovania sa a poškodenia membrány červenej krvinky, čo má za následok vyplavenie hemoglobínu do prostredia.

Potrebujeme:

• krv
• skúmavky, gumené zátky, stojan na skúmavky
• pipety
• 1% roztok NaCl
• destilovaná voda
• kvapkadlo

Pracovný postup:

• Označíme si 6 skúmaviek a do všetkých napipetujeme NaCl a destilovanú vodu podľa tabuľky:

  skúmavka č.	1	2	3	4	5	6
  1% NaCl v ml	8	7	6	5	4	3
  destilovaná voda v ml	2	3	4	5	6	7
  koncentrácia roztoku	0,8%	0,7%	0,6%	0,5%	0,4%	0,3%

• Do každej skúmavky pridáme 2 kvapky krvi a obsah premiešame.
• Po 1 až 2 hodinách, keď erytrocyty sedimentovali, úlohu vyhodnotíme.
• Zisťujeme, že v skúmavkách s vyššou koncentráciou NaCl, blízkou koncentrácii fyziologickému roztoku, hemolýza nenastala, všetky červené krvinky klesli na dno a vytvorili súvislý sediment ostro ohraničený od bezfarebného NaCl.
• V ďalších skúmavkách sa hypotonický roztok podľa stupňa hemolýzy červených krviniek sfarbuje do červena a množstvo usadených červených krviniek je stále menšie.
• Prvá skúmavka, v ktorej sa objavilo slabo červené sfarbenie udáva minimálnu osmotickú rezistenciu.
• Maximálna osmotická rezistencia je daná tou koncentráciou NaCl, v ktorej je červené zafarbenie najintenzívnejšie a ktorá neobsahuje už žiadny sediment, všetky červené krvinky hemolyzovali.

Objem červených krviniek v pomere k celkovému objemu krvi sa nazýva hematokritovou hodnotou. Hematokritová hodnota nás informuje nielen o objeme červených krviniek vzhľadom k celkovému objemu krvi, ale môžeme z nej usudzovať aj ich absolutné množstvo. Hematokritovú hodnotu určujeme tak, že odstredením oddelíme krvinky od plazmy, čo nám umožní odčítať ich objemový podiel.

Potrebujeme:

• krv
• hematokritové skúmavky
• vatové tampóny
• plastelína
• centrifúga

Pracovný postup:

• Do pipetky na stanovenie hematokritovej hodnoty nasajeme vyšetrovanú krv.
• Znečistenú pipetku zvonku očistíme vatovým tampónom.
• Jeden koniec pipetky uzatvoríme pomocou plastelíny, aby krv z pipetky počas centrifugácie nevytiekla.
• Vložíme pipetky s krvou do centrifúgy a centrifugujeme 15 minút pri 3000 otáčkach za minútu.
• Počas odstreďovania sa v pipetke oddeľujú krvné elementy od plazmy, pričom červené krvinky vytvoria najspodnejšiu súvislú tmavočervenú nepriehľadnú vrstvu, nad ktorou je tenká, belavá vrstvička bielych krviniek a krvných doštičiek a širšia, slaboţltá priehľadná vrstva plazmy.
• Po centrifugácii pomocou počítadla na stanovenie hematokritovej hodnoty krvi odčítame hematokritovú hodnotu vyšetrovanej krvi.
• Hematokrit je vyjadrený v %.
• Aby sa stanovila presnejšia hodnota, odporúča sa zistený objem erytrocytov vynásobiť číslom 0,95 pretoţe aj po dokonalom odstredení zostáva ešte pribliţne 5% plazmy medzi krvinkami.

Čerstvú alebo defibrovanú krv riedime v sklenenej skúmavke fixačným roztokom , ktorý sfarbí jadrá bielych krviniek na modro. Zriedenú krv prenášame na Bürkerovu počítaciu komôrku a sčítame krvinky v jednotlivých štvorcoch.

Potrebujeme:

• krv
• pipetka o obsahu 0,025 ml
• pipetka o obsahu 0,475 ml
• pasteurova pipetka
• sklenená skúmavka na riedenie
• Türkov roztok
• Bürkerova počítacia komôrka
• mikroskop
• vatové tampóny

Pracovný postup:

• Do pipetky o obsahu 0,475 ml nasajeme Türkov roztok a prenesieme ho do sklenenej skúmavky na riedenie.
• Do druhej pipetky o obsahu 0,025 ml nasajeme vyšetrovanú krv.
• Znečistenú pipetku zvonku očistíme vatovým tampónom.
• Krv kvantitatívne prenesieme do Türkovho roztoku a pipetku 3 krát prepláchneme.
• Sklenenú skúmavku uzavrieme gumenou zátkou a 3 minúty ju miešame.
• Dostaneme zriedenú krv v pomere 1:20.
• Kvapku zriedenej krvi prenesieme na Bürkerovu počítaciu komôrku a počítame biele krvinky vo veľkých štvorcoch.
• Počítame v 1, 4, 7 a 10, a z 12 radu pripočítame ešte dva štvorce, t. j. spolu 50 štvorcov.
• Súčet krviniek dosadíme do vzorca: P={(p.v.h.z)/y}.10⁶
  • P - celkový počet krviniek v 1 litri krvi,
  • p - počet napočítaných krviniek,
  • v - prevrátená hodnota plochy jedného políčka, v ktorom sme počítali krvinky,
  • h – prevrátená hodnota hĺbky komôrky,
  • z – zriedenie krvi,
  • y – počet políčok, v ktorých sme krvinky počítali.

Celkový počet krviniek v 1 litri je vyjadrený v 10⁹, čo predstavuje vlastne G (giga) G=10⁹. Počet krviniek vyjadríme G.l^-1.

Reakcia slín závisí predovšetkým od charakteru prijatého krmiva. Reakcia slín je slabo zásaditá (7,1 - 8,5), čo je spôsobené prítomnosťou zásaditých solí v slinách. Alkalická reakcia slín je dôležitá, pretože slinami sa neutra¬lizujú prijaté a vzniknuté kyseliny.

Princíp:

Reakciu slín určíme podlá farebnej zmeny indikátorového papierika.

Potrebujeme:

• indikátorový papierik
• hodinové sklíčko

Pracovný postup:

• Na hodinové sklíčko nanesieme kvapku slín.
• Do slín namočíme indikátorový papierik.
• Zmenu zafarbenia papierika porovnáme so stupnicou a tak určíme reak¬ciu slín.
• Presné stanovenie reakcie slín môžeme urobiť pomocou pristroja na mera¬nie koncentrácie H+ iónov.
• Počas odstreďovania sa v pipetke oddeľujú krvné elementy od plazmy, pričom červené krvinky vytvoria najspodnejšiu súvislú tmavočervenú nepriehľadnú vrstvu, nad ktorou je tenká, belavá vrstvička bielych krviniek a krvných doštičiek a širšia, slaboţltá priehľadná vrstva plazmy.

Kontrolné otázky:

1. Čo vplýva na reakciu slín?
2. Aký význam má rôzna reakcia slín na ďalší proces trávenia?
3. Prečo má hovädzí dobytok silne zásaditú reakciu slín?

Sliny všežravcov obsahujú diastatický enzým ptyalín (amyláza), ktorý štiepi glykozidickú väzbu cez dextríny na maltózu. Maltóza redukuje jód na bezfarebný jodid.

Princíp:

Na základe farebnej reakcie s jódom zisťujeme množstvo ro¬zloženého škrobu ptyalínom pri rôznom pH a pri rôznej teplote.

Potrebujeme:

• skúmavky
• pipety
• kadičky
• Lugolov roztok
• 10 % Na₂CO₃
• 2 % škrobový maz
• vodný kúpeľ
• ľad
• stojan na skúmavky
• filtračný papier

Pracovný postup:

• Ústnu dutinu si 1 - 2 minúty vyplachujeme asi 20 ml destilovanej vody.
• Výplašok prefiltrujeme do kadičky a získame roztok slinných enzýmov.
• Označíme si šesť skúmaviek, do ktorých následne pridáme:
1. 2 ml škrobový maz + 1 ml slinný roztok
2. 2 ml škrobový maz + 1 ml slinný roztok
3. 2 ml škrobový maz + 1 ml H₂O
4. 2 ml škrobový maz + 1 ml H₂O
5. 2 ml škrobový maz + 1 ml HCl + 1 ml slinný roztok
6. 2 ml škrobový maz + 1 ml Na₂CO₃ + 1 ml slinný roztok
• Skúmavky 1, 3, 5 a 6 dáme na 20 minút do vodného termostatu 40°C teplého.
• Skúmavku 2 a 4 na 20 minút do ľadu.
• Po tomto Čase skúmavky vyberieme, ochladíme pod studenou vodou.
• Potom do všetkých skúmaviek pridáme 2 kvapky Lugolovho roz¬toku a pozorujeme zafarbenie obsahu skúmaviek.
• Pokus vyhodnotíme.

Kontrolné otázky:

1. Aké sú optimálne podmienky pre pôsobenie enzýmov slín?
2. Ktoré enzýmy sa nachádzajú v slinách?
3. Ktoré zložky potravy sa môžu rozkladať slinami?

Žalúdočná šťava, ako sekrét fundálnej časti žalúdka sa skladá z vody, anorganických a organických látok. Hlavnými zložkami žalúdočnej šťavy sú en¬zýmy. Pre trávenie bielkovín má najväčší význam enzým pepsín, ktorý hydrolyticky štiepi bielkoviny a polypeptidy. Tvorí sa v hlavných bunkách žalúdočných žliaz ako neúčinný pepsinogén. Vplyvom HCl je aktivovaný na aktívny pepsín.

Princíp:

Zisťujeme tráviaci účinok žalúdočnej šťavy na bielkoviny v rôznom prostredí.

Potrebujeme:

• žalúdočná šťava
• skúmavky
• držiak na skúmavky
• pipety
• N/1 NaOH
• vodný termostat
• ľad
• stojan
• kahan

Pracovný postup:

• Pripravíme si 5 skúmaviek a dáme do nich:
1. fibrín + 2 ml žalúdočná šťava
2. fibrín + 2 ml žalúdočná šťava
3. fibrín + 2 ml prevarená žalúdočná šťava
4. fibrín + 1 ml NaOH + 2 ml žalúdočná šťava
5. fibrín + 2 ml H₂O
• Skúmavku č. 2 dáme na 45 minút do ľadu.
• Ostatné skúmavky na 45 minút do vodného termostatu pri teplote 37°C.
• Po tomto čase skúmavky vyberieme a pozorujeme zme¬ny na fibríne.
• Pokus vyhodnotíme.

Kontrolné otázky:

1. Aké je zloženie žalúdočnej šťavy?
2. Pri akom pH štiepi žalúdočná šťava bielkoviny?

Žalúdočná šťava, ako sekrét fundálnej časti žalúdka sa skladá z vody, anorganických a organických látok. Hlavnými zložkami žalúdočnej šťavy sú en¬zýmy. Pre trávenie bielkovín má najväčší význam enzým pepsín, ktorý hydrolyticky štiepi bielkoviny a polypeptidy. Tvorí sa v hlavných bunkách žalúdočných žliaz ako neúčinný pepsinogén. Vplyvom HCl je aktivovaný na aktívny pepsín.

Princíp:

Zisťujeme tráviaci účinok pepsínu na bielkoviny v rôznom prostredí.

Potrebujeme:

• fibrín
• 0,2 % roztok pepsínu vo vode
• 10 % Na₂CO₃
• 0,2 % HCl
• skúmavky
• držiak na skúmavky
• pipety
• vodný termostat
• ľad
• stojan
• kahan

Pracovný postup:

• Pripravíme si 5 skúmaviek. Do každej dáme:
1. fibrín + 2 ml pepsínu + 3 ml HCl
2. fibrín + 2 ml pepsínu + 3 ml HCl
3. fibrín + 2 ml prevareného pepsínu + 3 ml HCl
4. fibrín + 2 ml pepsínu
5. fibrín + 2 ml pepsínu + 2 ml Na₂CO ₃
• Skúmavky č. 1, 3, 4, 5 vložíme na 45 minút do 37°C teplého vodného termostatu.
• Skúmavku č. 2 na ten istý čas do ľadu.
• Po tomto čase skúmavky vyberieme.
• Pokus vyhodnotíme.

Princíp:

Mlieko zrážame chymozínom a žalúdočnou šťavou v rôznych podmienkach.

Potrebujeme:

• mlieko
• chymozín
• žalúdočná štava
• skúmavky
• stojan na skúmavky
• pipety
• vodný termostat
• ľad

Pracovný postup:

• Pripravíme a označíme si 5 skúmaviek. Pipetujeme do nich:
1. 5 ml mlieko + 0,5 ml chymozínu
2. 5 ml mlieko + 0,5 ml chymozínu
3. 5 ml mlieko + 1 ml žalúdočná šťava
4. 5 ml mlieko + 1 ml žalúdočná šťava
5. 5 ml mlieko + 1 ml H₂O
• Obsah skúmaviek dobre premiešame.
• Skúmavku č. 2 a 4 dáme na 15 minút do ľadu.
• Skúmavky č. 1, 3 a 5 na ten istý čas do 37°C teplého vodného termostatu.
• Po tomto čase skúmavky vyberieme.
• Pokus vyhodnotíme.

Kontrolné otázky:

1. Aké je optimálne pôsobenie pepsínu a aké chymozínu?/li>
2. U ktorých zvierat sa v prevažnej miere nachádza enzým chymozín?

Enzýmy pankreatickej šťavy trávia sacharidy až na monosacharidy. Pankrea¬tická amyláza rozkladá polysacharidy, hlavne škrob cez dextríny až na maltózu. Maltóza je štiepená maltázou až na glukózu.

Princíp:

Zisťujeme tráviaci účinok pankreatickej amylázy v rôznom prostredí.

Potrebujeme:

• škrobový maz
• pankreatická šťava
• 10 % HCl
• 10 % Na₂CO₃
• Lugolov roztok
• skúmavky
• stojan na skúmavky
• pipety
• vodný termostat
• ľad

Pracovný postup:

• Označíme si šesť skúmaviek, do ktorých dáme:
1. 1 ml škrobový maz + 3 ml pankreatická šťava
2. 1 ml škrobový maz + 3 ml pankreatická šťava
3. 1 ml škrobový maz + 3 ml prevarená pankreatická šťava
4. 1 ml škrobový maz + 1 ml HCl + 3 ml pankreatická šťava
5. 1 ml škrobový maz + 1 ml Na₂CO₃ + 3 ml pankreatická šťava
6. 1 ml škrobový maz + 3 ml H₂O
• Skúmavku č. 2 vložíme na 60 minút do ľadu.
• Ostatné skúmavky na rovnaký čas do vodného termostatu pri 37°C.
• Po tomto čase urobíme skúšku na prítomnosť škrobu Lugolovým roztokom.
• Skúmavky, v ktorých je zásadité prostredie zneutra¬lizujeme, nakoľko v zásaditom prostredí sa jód odfarbuje.
• Výsledky pokusu vyhodnotíme.

Kontrolné otázky:

1. Ktoré zložky pankreatickej šťavy sa podieľajú na trávení cukrov?
2. Aké je zloženie pankreatickej šťavy?

Pankreatická lipáza hydrolyzuje neutrálne tuky na glycerol a mastné ky¬seliny. Jej činnosť zvyšujú soli žlčových kyselín tým, že emulgujú neutrálne tuky v čreve.

Princíp:

Zisťujeme účinok pankreatickej lipázy na tuky v rôznom prostredí.

Potrebujeme:

• olej
• pankreatická šťava
• fenolftaleín
• žlč
• 10 % Na₂CO₃
• 5 % CaCl₂
• skúmavky
• stojan na skúmavky
• pipety
• vodný termostat
• ľad

Pracovný postup:

• Označíme 6 skúmaviek.
• Do všetkých skúmaviek napipetujeme 1 ml oleja, 0,5 ml CaCl₂, 1 ml Na₂CO₃ a 2 kvapky fenolftaleínu.
• Potom pokračujeme nasledovne, do každej skúmavky pridáme:
1. + 2 ml pankreatická šťava
2. + 2 ml pankreatická šťava
3. + 2 ml prevarená pankreatická šťava
4. + 0,5 ml žlče + 2 ml pankreatická šťava
5. + 0,5 ml žlče + 2 ml pankreatická šťava
6. + 2 ml H₂O
• Obsah skúmaviek riadne premiešame.
• Podľa potreby pridáme Na₂CO₃, aby intenzita ružového zafarbenia bola vo všetkých skúmavkách rovnaká.
´
• Skúmavky č. 2 a 5 vložíme na 10 minút do ľadu.
• Ostatné skúmavky do 37°C teplého vodného termostatu na rovnaký čas.
• Po tomto čase skúmavky schladíme a pozorujeme zme¬ny v zafarbení.
• Pokus vyhodnotíme.

Kontrolné otázky:

1. Vymenujte funkcie žlče.
2. Aký je vplyv žlče na rýchlosť rozkladu tukov?

Hlavnými zložkami žlče sú soli žlčových kyselín, žlčové farbivá a cholesterol. Žlč má značný význam pre trávenie tukov. Soli žlčových kyselín znižujú povrchové napätie roztokov, napomáhajú stálosti tukovej emulzie. Majú tiež priaznivý vplyv na pankreatickú lipázu tým, že ju aktivizujú. Na základe tvorby komplexov soli žlčových kyselín s vyššími mastnými kyselinami umožňujú ich vstrebávanie.

Princíp:

Pozorujeme vznik a stálosť tukovej emulzie v rôznych roz¬tokoch, rýchlosť filtrácie tuku v rôznych podmienkach a schopnosť znižovania povrchového napätia.

Potrebujeme:

• olej
• žlč
• prášková síra
• skúmavky
• stojan na skúmavky
• pipety
• liviky
• filtračný papier
• vodný termostat

Pracovný postup:

• Označíme si 6 skúmaviek.

  a)

  • Do skúmavky 1 a 2 dáme lieviky.
  • Do lievika na 1. skúmavke dáme filtračný papier namočený vo vode.
  • Do lievika na 2. skúmavke dáme filtračný papier namočený v žlči.
  • Pozorujeme rýchlosť filtrácie oleja 40°C teplého cez oba filtračné papiere.

  b)

  • Do skúmavky 3 dáme 5 ml žlče, 0,5 ml oleja a 1 ml vody.
  • Do 4. skúmavky dáme 6 ml vody a 0,5 ml oleja.
  • Skúmavky intenzívne pretrepeme a pozorujeme stálosť emulzie.

  c)

  • Do skúmavky 5 dáme 5 ml žlče.
  • Do skúmavky 6 dáme 5 ml vody.
  • Do oboch skúmaviek opatrne nasypeme práškovú síru.
  • Porovnávame veľkosť povrchového napätia žlče a vody.
• Pokus vyhodnotíme.

Kontrolné otázky:

1. Popíšte zloženie žlče.

1. Do skúmavky č.1 napipetujeme 0,02 ml destilovanej vody (reagenčný blank).
2. Do skúmavky č. 2 napipetujeme 0,02 ml vzorky (vyšetrované sérum).

• Do skúmaviek pridáme 1,0 ml činidla (Biuretove činidlo).
• Obsah skúmaviek premiešame a necháme inkubovať pri laboratórnej teplote (teplote miestnosti) 15 minút.
• Po uplynutí 15 minút meriame absorbanciu na Spekole pri vlnovej dĺžke 540 nm.
• Absorbanciu vzorky (skúmavka č. 2) odčítame proti reagenčnému blanku (skúmavka č. 1).

Výpočet:

Celkové bielkoviny (g/l) = (abosrbanncia vzorky / absorbanica štandardu 0,260) * 57,5

1. Do skúmavky č. 1 napipetujeme 0,01 ml destilovanej vody (reagenčný blank).
2. Do skúmavky č. 2 napipetujeme 0,01 ml vzorky (vyšetrované sérum).
3. Do skúmavky č. 3 napipetujeme 0,01 ml štandardu (kalibrátor).

• Do všetkých troch skúmaviek pridáme 1,0 ml činidla (pre stanovenie albumínov).
• Obsah skúmaviek premiešame a necháme inkubovať 5 minút pri teplote 37 oC v termostate.
• Po uplynutí 5 minút meriame absorbanciu na Spekole pri vlnovej dĺžke 578 nm.
• Absorbanciu vzorky (skúmavka č. 2) a absorbanciu štandardu (skúmavka č. 3) odčítame proti reagenčnému blanku (skúmavka č. 1).

Výpočet:

Albumíny (g/l) = (abosrbanncia vzorky / absorbanica štandardu) * C štandardu

1. Do skúmavky č. 1 napipetujeme 0,01 ml destilovanej vody (reagenčný blank).
2. Do skúmavky č. 2 napipetujeme 0,01 ml vzorky (vyšetrované sérum).
3. Do skúmavky č. 3 napipetujeme 0,01 ml štandardu (kalibrátor).

• Do všetkých troch skúmaviek pridáme 1,0 ml činidla (pre stanovenie glukózy).
• Obsah skúmaviek premiešame a necháme inkubovať 5-10 minút pri teplote miestnosti.
• Po uplynutí 5-10 minút meriame absorbanciu na Spekole pri vlnovej dĺžke 500 nm.
• Absorbanciu vzorky (skúmavka č. 2) a absorbanciu štandardu (skúmavka č. 3) odčítame proti reagenčnému blanku (skúmavka č. 1).

Výpočet:

Glukóza (mmol/l) = (abosrbanncia vzorky / absorbanica štandardu) * 10,7

1. Do skúmavky č. 1 napipetujeme 0,01 ml destilovanej vody (reagenčný blank).
2. Do skúmavky č. 2 napipetujeme 0,01 ml vzorky (vyšetrované sérum).
3. Do skúmavky č. 3 napipetujeme 0,01 ml štandardu (kalibrátor).

• Do všetkých troch skúmaviek pridáme 1,0 ml činidla (pre stanovenie močoviny).
• Obsah skúmaviek premiešame a meriame absorbanciu proti reagenčnému blanku.
• Najskôr odčítame počiatočnú absorbanciu vzorky aj kalibrátora po 30 sekundách (A1) a začneme merať čas.
• Znovu odčítame absorbanciu vzorky aj kalibrátora presne po 1 minúte (A2).
• Vypočítame zmenu absorbancie vzorky ∆Avz = (A2 – A1) za min. aj zmenu absorbancie štandardu (kalibrátora) ∆Akal = (A2 – A1) za min. a dosadíme do vzorca:

Výpočet:

Močovina (mmol/l) = (∆A vzorky / ∆A štandardu) * C štandardu

1. Do skúmavky č. 1 napipetujeme 0,01 ml destilovanej vody (reagenčný blank).
2. Do skúmavky č. 2 napipetujeme 0,01 ml vzorky (vyšetrované sérum).

• Do skúmaviek pridáme 1,0 ml činidla (pre stanovenie horčíka).
• Obsah skúmaviek premiešame.
• Skúmavky inkubujeme 5 minút pri teplote 37 °C v termostate.
• Po uplynutí 5 minút meriame absorbanciu na Spekole pri vlnovej dĺžke 520 nm.
• Absorbanciu vzorky (skúmavka č. 2) odčítame proti reagenčnému blanku (skúmavka č. 1).

Výpočet:

Horčík (mmol/l) = (absorbancia vzorky / absorbancia štandardu 0,135) * 0,824

1. Do skúmavky č. 1 napipetujeme 0,01 ml destilovanej vody (reagenčný blank).
2. Do skúmavky č. 2 napipetujeme 0,01 ml vzorky (vyšetrované sérum).
3. Do skúmavky č. 3 napipetujeme 0,01 ml štandardu (kalibrátor).

• Do skúmaviek pridáme 1,0 ml činidla (pre stanovenie fosforu).
• Obsah skúmaviek premiešame.
• Skúmavky inkubujeme 5 minút pri teplote 37 °C v termostate.
• Po uplynutí 5 minút meriame absorbanciu na Spekole pri vlnovej dĺžke 345 nm.
• Absorbanciu vzorky (skúmavka č. 2) a absorbanciu štandardu (skúmavka č. 3) odčítame proti reagenčnému blanku (skúmavka č. 1).

Výpočet:

Fosfor (mmol/l) = (absorbancia vzorky / absorbancia štandardu) * C štandardu

1. Do skúmavky č. 1 napipetujeme 0,01 ml destilovanej vody (reagenčný blank).
2. Do skúmavky č. 2 napipetujeme 0,01 ml vzorky (vyšetrované sérum).
3. Do skúmavky č. 3 napipetujeme 0,01 ml štandardu (kalibrátor).

• Do všetkých skúmaviek pridáme 1,0 ml činidla (pre stanovenie triacylglycerolov).
• Obsah skúmaviek premiešame.
• Skúmavky inkubujeme 10 minút pri teplote 37 °C v termostate.
• Po uplynutí 10 minút meriame absorbanciu na Spekole pri vlnovej dĺžke 500 nm.
• Absorbanciu vzorky (skúmavka č. 2) a absorbanciu štandardu (skúmavka č. 3) odčítame proti reagenčnému blanku (skúmavka č. 1).

Výpočet:

Triacylglyceroly (mmol/l) = (absorbancia vzorky / absorbancia štandardu) * C štandardu

Kalibrátor

• Absorbanciu meriame pri vlnovej dĺžke 340 nm.
• Do kyvety napipetujeme 45μl kalibračného roztoku.
• Pridáme 1000 μl pracovného roztoku a spustíme stopky.
• Následne vložíme kyvetu do prístroja (spektrofotometra).
• Po 1 minúte odčítame absorbanciu na prístroji, dostaneme hodnotu A1.
• Po 2 minúte rovnako odčítame absorbanciu a dostaneme hodnotu A2.
• Po 3 minúte dostaneme hodnotu absorbancie A3.

Vzorka

• Rovnako postupujeme s vyšetrovanou vzorkou.
• Dostaneme hodnoty absorbancie A1, A2, A3 vzorky

Výpočet absorbancií kalibrátora a vzorky:

ΔA = (A3 - A1) / 2

Výpočet AST:

AST (µ/l) = (ΔA min. vzorky / ΔA min. kalibrátora) * koncetrácia kalibrátora (µ/l)

Kalibrátor

• Absorbanciu meriame pri vlnovej dĺžke 340 nm.
• Do kyvety napipetujeme 45μl kalibračného roztoku.
• Pridáme 1000 μl pracovného roztoku a spustíme stopky.
• Následne vložíme kyvetu do prístroja (spektrofotometra).
• Po 1 minúte odčítame absorbanciu na prístroji, dostaneme hodnotu A1.
• Po 2 minúte rovnako odčítame absorbanciu a dostaneme hodnotu A2.
• Po 3 minúte dostaneme hodnotu absorbancie A3.

Vzorka

• Rovnako postupujeme s vyšetrovanou vzorkou.
• Dostaneme hodnoty absorbancie A1, A2, A3 vzorky

Výpočet absorbancií kalibrátora a vzorky:

ΔA = (A3 - A1) / 2

Výpočet ALT:

ALT (µ/l) = (ΔA min. vzorky / ΔA min. kalibrátora) * koncetrácia kalibrátora (µ/l)

Princíp:

Ide o imunochemickú metódu, ktorá je založená na využití protilátok, fungujúcich ako špecifický väzbový činiteľ. Princípom tejto kvalitatívno-kvantitatívnej sérologickej metódy je teda reakcia špecifickej protilátky naviazanej na povrch 96-jamkovej platničky s antigénom (hormón, prítomný vo vzorke). Antigén však súperí s konjugátom (chrenová peroxidáza) o väzbové miesto na spomínanej špecifickej protilátke. Ide o súťaženie značeného a neznačeného antigénu o väzobné miesto. Značený antigén (konjugát), ktorý je dodávaný výrobcom obsahuje známe množstvo konkrétneho hormónu. Naopak neznačený antigén je skúmaná vzorka, v ktorej koncentráciu hormónu determinujeme.